湖南辣鱼美食研发组

中国家长的愤怒:老子在美国已经花了200万了,我女儿还是被判了13年!

爱无界文化传播2019-10-20 07:52:46

优秀的家庭,始于陪伴,陷于教育,忠于三观。

如果把孩子的教育比作一条河流,社会和学校教育不当,只是污染了水流。

但如果一个家庭里,父母三观不正,则是污染了水源。一旦水源被污染了,那祸害便是无穷的。

曾震惊中外的“中国留美学生虐待同学案”就是典例。

因男女情感琐事,十余名中国留美学生以扒光衣服、强迫吃沙子、剪掉头发、拿烟头烫乳头等残忍手段,将同班同学刘某虐待长达7个小时。事后,刘某在当地报警。

案件最终在洛杉矶高等法院宣判,主犯翟芸瑶、章鑫磊和杨玉菡三人分别被判13年、6年和10年的监禁。

对于审判结果,家长表示难以接受:不过是孩子间的打打闹闹,怎么就要判刑坐牢?

一位犯案同学的家长甚至不远万里飞来贿赂受害人,想私下以金钱摆平此事。

另一位家长则愤怒不平地表示,为孩子的官司自己已经花费了超过200万人民币,如果在国内,孩子就不会走到今天这一步了。

真是可笑又可悲的家长!直到此刻,也未能醒悟自己为人父母的失职和过错。

父母是原件,孩子是复印件,当复印件出问题的时候,根源应该从原件上找,而这个根源,便是父母的三观。

父母三观不正、是非不辩,孩子走入歧途也只是迟早的事情。

同样是欺凌事件,三观不同的父母,应对的方式也截然不同。

前阵子,美国弗吉尼亚州的一位父亲“惩罚”10岁孩子的视频在网络上大火。

因10岁的儿子在校车上欺负同学,父亲惩罚孩子连续一周不能坐校车,每天必须跑1英里(约等于1.6千米)去上学,即使刮风下雨也不停歇。

担心儿子安全,父亲便每日开车尾随相伴。并在Facebook上直播打卡。


(请在wifi环境下观看 时长1'36'')

视频中,印象中最深刻的是父亲说的这三句话:

因为孩子爱欺负别人,我对这点是不能容忍的。

自从他跑步上学后,他的行为好多了。老师们对他这周的表现都很满意。

这是惩罚孩子的一种健康方式。这便是育儿。

对于这个10岁的孩子而言,如果不是父亲及时的引导和教育,或许未来他就是校园凌霸中的一员。

孩子在成长过程中,难免犯错,而父母正确的三观,就是其成长道路上的导航仪,能把偏航的自己及时拉回正轨。

而这个世界上,每多一个三观正的父母,或许就会少一个无法无天的熊孩子。

有人说,没教养的孩子背后,都站着一对三观不正的父母。

娇妈对此深以为然。

不久前,一对中国夫妻带着6岁的孩子,去美国洛杉矶度假。

可飞机刚落地,一家三口却被FBI全副武装的执法人员遣送回国了。

起因是,孩子在飞机上各种闹腾,还一直对旁边的日本华裔小哥拳打脚踢,叽叽歪歪。

小哥在几经包容之后,礼貌地请求孩子的父母能否管教好自己的孩子,结果父母直接无视。

后来实在忍无可忍,日本小哥便痛骂了孩子一顿,孩子的父亲却因此和日本小哥扭打了起来。

遣返回国属于驱逐出境,这一家三口经此一闹,几乎再无出国游玩的机会了。

同样是带孩子坐飞机,宁波这位妈妈的做法却大获赞扬。

因害怕孩子的哭闹会给其他乘客造成困扰,妈妈事先准备了一张小卡片,并给每位乘客赠送了一副耳塞和两颗糖果。

(左边为小卡片,右边为耳塞和糖果)

飞行全程,宝宝不哭不闹,也特别懂事,不仅没给乘客造成困扰,还带去了令人感动的小温暖。

两相对比,孩子的教养其实就藏在父母的三观里;孩子的表现就是父母三观的体现。

家是孩子的第一所学校,父母是孩子的第一任老师。想要收获一个有教养的孩子,父母不仅需要谨言慎行,更需要有一个好三观。

事实上,父母的三观里,不仅藏着孩子的教养,更藏着孩子二十年后的未来。

在众所周知的富二代中,格力电器老总董明珠的儿子董东东是出了名的低调务实、认真勤奋。

而让董东东从小保持良好秉性的主要原因,就在于其母亲灌输的良好三观。

当年,丈夫因病去世时,儿子东东才2岁。为了撑起这个家,董明珠决定下海经商。

随着生意越做越大,家中条件日趋富裕,但董明珠依然坚持给儿子灌输勤俭、吃苦耐劳的精神。

一次,出差回来的董明珠开车路过儿子学校,正逢放学。本想顺道接儿子回家,但一想自己开着豪车接儿子或许会助长其炫富或攀比的不良心理,于是她果断掉转车头回家了。

那一次,儿子比平时放学晚回家了半个小时,董明珠便问其原因,儿子说:“有空调的公交车要2元,没有空调的公交车只要一元。我回来晚了是在等那辆一元钱的公交车”。

转眼二十年过去了。

长大后的董东东,早已凭借自己的勤奋和努力,与家财万贯的妈妈比肩而立。

媒体采访,他总是说:我的妈妈是从零开始的,我是她的儿子,我也可以从零开始。这便是我成功的原因。

著名主持人董卿曾说过,你希望孩子成为什么样的人,最简单的方法就是你去做什么样的人。未来,在孩子真正懂得的时候,他会对你有爱,也有尊敬。

这句话用来形容董明珠与儿子董东东,实在是再恰当不过了。

一流的父母做榜样,二流的父母做教练,三流的父母做保姆。而父母能够给孩子最好的榜样,便是教给孩子正确的三观。

著名诗人多萝西·劳·诺尔蒂曾写过这样一首诗:《孩子是父母的镜子》

如果孩子生活在分享中,他们将学会慷慨;

如果孩子生活在诚实中,他们将学会正直;

如果孩子被公平对待,他们将学会正义;

如果孩子被关心和体谅,他们将学会尊重;

家是孩子的第一所学校,父母是孩子的第一任老师。

孩子的未来,藏在父母的一言一行中,更藏在父母的三观里。

而我也一直坚信,优秀的家庭,始于陪伴,陷于教育,忠于三观。

愿为人父母的我们,都能用最清澈的源泉,浇灌孩子最纯洁的心灵,给孩子留下一片明媚阳光的未来。


赞赏



摘  要 生物监测是环境监测重要部分,当前我国环境监测主要依赖化学分析监测,近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛,但基于我国环境监测标准限制,我国生物监测发展一直处于研究阶段,当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种,对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查,因此亟待发展我国水生实验生物,尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物,为加强其背景生物学研究,系统研究了河蚬生物标志物,最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。 主要研究内容与结果如下: 1)利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息,获得了28799934条高质量序列,鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs;荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高,而miR-10和Novel-2各自在鳃和内脏团中表达最高;预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关,为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础。 2)采用RACE技术,成功克隆获得河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列, 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征,并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布;有机磷酸酯对神经肽显著调节,表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物,为环境污染物生物监测提供技术手段。 3)结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯(TDCPP和TBP)毒理作用机制,多指标结果表明长期低剂量暴露下,主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路,酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡。 关键词:河蚬,miRNA,有机磷酸酯,凋亡通路,生物标志物 ABSTRACT Biological monitoring is an important part of environmental monitoring. Currently the environmental monitoring in China mainly depended on the chemical analysis and monitoring. In recent years, although the internationally biological monitoring technology development is rapid, based on restrictions of our standard of environmental monitoring, the development of biological monitoring in our country has been in the research stage. Currently, biological monitoring manly relies on algae, Daphnia and fish aquatic species, for large benthic current monitoring depends only on biodiversity survey. Therefore, it is urgent to develop aquatic laboratory animals in our country, particularly to strengthen the screening of large benthic biomarkers and modeling study. Therefore in this study the widespread mollusk-Corbicula fluminea in our country was taken as an experimental organism, to strengthen the biological background research, we systematically study biomarkers of the Corbicula fluminea in monitoring environmental pollutants. Finally, we discuss mechanism of environmental pollutants on Corbicula fluminea through the above markers. The main research contents and results are as follows: 1) Through Illumina sequencing we obtained the Corbicula fluminea miRNA biological information, and obtained the 28799934 high quality sequences, then identified 45 conservative and 39 new Corbicula fluminea miRNAs; Fluorescence quantitative PCR results showed that nine miRNAs of 12 were expressed highest in the gastropod, while miR-10 and Novel-2 was expressed highest respectively in gill and visceral mass; Software prediction results showed that miRNAs related to environmental pollution genes, this provides a molecular biological basis for Corbicula fluminea as an experimental organism. 2) Through RACE technology, we successfully cloned the Corbicula fluminea the full-length cDNA sequence of CCK, Conopression and FFamide, predicted the molecular structure of Corbicula fluminea CCK, Conopression and FFamide protein, and analyzed the distribution of neuropeptide expression in different tissues of Corbicula fluminea; the organic phosphate significantly increased the expression of neuropeptide, indicating that the CCK, and Ffamide Conopression can be taken as Corbicula fluminea biomarkers and this provides a technical means for the biological monitoring of environmental pollutants. 3) By combining with transcriptome sequencing technology and fluorescence quantitative PCR we analysis  the toxicological mechanism of typical organic phosphate(TDCPP and TBP), Multiple indicators showed that long-term low-dose exposure mainly effect apoptosis pathway, focal adhesion pathway, small cell lung cancer pathway and cell adhesion molecular pathways, the detect of caspase enzyme activity and apoptosis related genes confirmed that typical organic phosphate significantly induced Corbicula fluminea cell apoptosis.   Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加,环境中的污染物越来越多,对人和动植物的健康造成了潜在威胁,大量研究表明,水体中的污染物随着营养能级的提高,难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2],而作为营养级最高的人类,自然会遭受很大的环境风险,而常规的化学法监测效率低,成本高,监测品种少,难以满足快速增长的污染物品种,因此使用生物作为监测工具,开发相关的生物标志物,对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量的环境污染物时,在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警,开发出相应生物标志物就能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况,比传统化学法更加具有优势。我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鲫的实时在线监测系统,目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况,为我们使用安全的饮用水提供了预警,运用了稀有鮈鲫对污染物的敏感特点。 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用,发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤,不是通过caspase途径,ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应,发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物,开发出了氟西汀的相关生物标志物,发现河蚬在氟西汀暴露下,ATP结合转运蛋白基因受到抑制,而且超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛酶活性升高,指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下,发现乙酰胆碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物,其活性在高浓度受到明显抑制。相比较而言,河蚬等底栖生物的研究比较少,相关研究也主要是常规标志物,但底栖生物能直接反应水体污染现状,开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价,监测上去具有十分重大的意义。 1.2 microRNA与生物标志物 1.2.1 microRNA背景介绍 MicroRNAs (miRNAs) 是内源性的小无编码RNAs(典型的19到23个核苷酸),通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]。自从第一个miRNA(lin-4)在线虫中发现以来[11],大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]。目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17],人类中发现的miRNAs最多达到1881个前体[18]。在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17],此外,在珍珠贝中发现258个[19],在牡蛎中发现199个[20],然而淡水软体动物(如河蚬)还没有miRNAs的相关报道。 近期研究表明miRNAs与器官发育,细胞分化,细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外。37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且,厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候选的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能。尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能,但淡水软体动物的还不清楚。 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30],目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]。与传统的miRNAs鉴定方法(计算预测和直接克隆)相比,Solexa测序可以用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs,甚至在没有基因组数据的情况下[34]。 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相应的其靶基因表达也会发生改变。因此在环境毒理学研究中,miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物。王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露下,出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化,结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁,并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响,结果表明,72h氟虫腈暴露下,瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率,其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低。得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化,结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空白组分别显著性升高了2被和3.6倍,而其他miRNA没有观察到显著性变化,这个miRNA是与P53应答相关联。 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物,而水生动物特别是底栖动物没有相关研究,miRNA背景学资料相当缺乏,底栖生物能直接反应水体污染,其miRNA毒理学研究没有报道,急需进行相关研究。 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和,转录组对了解基因组的功能,揭露细胞和组织的分子成分,了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于:记录物种的所有转录本,包括mRNAs,非编码RNAs和小RNAs;决定基因的起始位点,5’和3’转录结构,剪切类型,其他转录后的变化;量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平。对于非模式生物,因为缺乏相关基因组信息,其遗传育种,生命特征等研究进展缓慢,传统的cDNA克隆,基因芯片技术耗时长,效率低,已经无法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展,第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具,与传统基因芯片,克隆技术相比,不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平,不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列,而且能检测稀有转录本和未知序列,提供丰富的转录组信息,为我们认识真核生物转录组信息提供了快速,高效,精确的测序技术。目前,已有人类细胞[38],老鼠[39],斑马鱼[40],河蚬[41],拟南芥[42],啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析,为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 目前,二代测序平台主要有三个,如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX),后来,单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术由Helicos Biosciences 公司推出。一个重要特点就是高通量,数以千万计的reads被测序。下表列举了这三个平台的异同点。 表1-1 几种测序平台优缺点 测序平台 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLX Helicos HeliScope 测序原理 可逆染料终 结合成测序 连接测序 焦磷酸合成 测序 单分子合成 测序 平均读长(bp) 100 35 400~700 21~35 运行时间(d/run) 3~10 7 0.5 5 美元/Mb碱基 0.05 0.15 15 1 主要错误类型 替换 替换 缺失与插入 缺失 准确率 ≧98.5% ≧99.94% ≧99.9% ≧99% 优点 性价比高 准确率最高 运行速度快,读长最长 产量高 缺点 读长短 运行时间长,读长短 错误率高,性价比低 错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例,转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]:1、RNA样品准备与质量控制;2、mRNA的纯化与片段化;3、cDNA文库第一链的合成;4、cDNA文库第二链的合成;5、末端修复与加A;6、PCR扩增;7、琼脂糖凝胶的纯化;8、cDNA库的质量控制;9、簇生成;10、上机测序并分析。流程图如下: 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大,往往需要使用专业的生物信息学分析,对测序得到的原始 reads(双端序列)进行质量评估和过滤后,将高质量的 reads 进行转录本的组装,对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上,再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。一般主流的比对数据库有:美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI),欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute, EMBI),COG(Clusters of Orthologous Groups)蛋白数据库,KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database)数据库。数据分析流程图如下: 图1-2 测序数据分析流程图 1.3.3 转录组测序技术在环境毒理学上的应用 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用:分子标记物的筛选与鉴定;环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸(PFOS)暴露后的青鳉转录组数据,发现青鳉蛋白和脂肪代谢,线粒体功能和神经系统等通路受到了影响;陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果,鉴定了9383个差异转录本,发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白,谷胱甘肽代谢,类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之,转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势,不仅可以获取受试生物高通量生物学信息,还能鉴定差异转录本,深入研究环境污染物的毒性效应和机制。 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义,分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子,由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素,神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质,神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态,包括生长、代谢和繁殖[49],例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现,首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来,并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年,大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来,如人,老鼠,猪和章鱼,这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为:速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中,许多神经肽也被发掘出来,有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47],而且目前还在不断扩充中,在功能上起到控制生殖,摄食,肌肉收缩,免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的,起到生理上控制鳃的作用[59],而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]。在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下,牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61]。 肠促胰酶肽(Cholecystokinin (CCK))首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62].在脊椎动物中,CCK广泛的分布于脑,据文献报道能减少鸟类,啮齿类动物,猪,羊,非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]。通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]。在软体动物在,CCK可能与一些综合感官功能有关,例如进食相关的行为,在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]。   Conopressin神经肽,首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71],随后在其他几个无脊椎动物中冶发现,例如牡蛎和蜗牛[56, 72]。文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关,在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74],是Rfamide肽家族的一员 [57],而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控,食物摄取,胃肠道和激素的调控,阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58, 75, 76]。而在软体动物中,文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide,并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77]。 1.4.1神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现,HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关。进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强,并随着时间推移越来越强[69]。MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理,发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高,但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响,总之,神经肽在环境毒理学上的应用也非常少,环境污染物对神经肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物(例如河蚬)的神经肽研究目前也没有报道,急需进行生物标志物的开发。 1.5 有机磷酸酯 1.5.1 有机磷酸酯介绍 自从一些溴代阻燃剂被禁用以来,有机磷酸酯(organophosphorus flame retardants,OPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性,产量大,具有可塑性,易生产,而被广泛的使用,如电子、装饰,化工,纺织等行业,因其是直接混入材料中,有机磷酸酯极易释放到外界环境中,从大气,水体,土地,生物体内都监测到有机磷酸酯的存在,而相关研究表明,有机磷酸酯性质稳定,难以降解,具有环境持久性,毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性,基因毒性和神经毒性,并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎,发现暴露引起了体重的减少,孵化率,存活率和心跳速率降低,增加了畸形率,进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平,而增加整体甲腺原氨酸水平,引起了甲状腺内分泌干扰效应。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇,卵黄蛋白原水平显著上升,相关的CYP11A,CYP17,GnRH基因表达量都发生改变,得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡,最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86],而在人居环境中大量存在有机磷酸酯,对人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 1.5.2 四种有机磷酸酯 磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tris(2,3-dichloropropyl) phosphate,TDCPP),使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂,据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88],环境中频繁的检测到了TDCPP的存在,如室内空气,灰尘,地表水,饮用水,河流,污水,沉积物和生物群体[88]。例如在地表水,报道TDCPP达到50 ng/L[89],而更高浓度的TDCPP在德国和挪威的污水处理厂出水中监测到,从20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]。而在生物体中,发现TDCPP在鲈鱼体中达到36–140 g/kg脂肪重量[91]。在中国的松花江和太湖的沉积物中都检测到了TDCPP,浓度分分别是2.5-40 ng/L和0.62-5.54 g/kg[92, 93]。而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强,虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94],而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯(Tributyl phosphate,TBP),广泛在核处理,化学工业,防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96],据报道引起了工人的恶心和头痛[97],环境中广泛存在,甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内,发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。 磷酸三(2-氯乙基)酯(Tris-(2-chloroethyl)-phosphate,TCEP)是一种典型的OPFRs,目前已经被列为痕量污染物名录[101],在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成,纺织品背面涂层,PVC,纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000吨,但在1997年降至4000吨[101]。然而,TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103],目前在地表水,污水处理厂出水,海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性,致畸性,致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。 磷酸三(丁氧基乙基)酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP)也是一种广泛使用的OPFRs,Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 2400-6100ng/L,每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程。目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名(Corbicula fluminea),一种双壳贝类,原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111],隶属软体动物门,瓣鳃纲(Lamellibranchis),真瓣鳃目(Eulamellibranchia),蚬科(Corbiculidae),蚬属(Corbicula)。是我国重要的淡水经济贝类之一,在20世纪初由移民传入欧洲和北美,由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖,且河蚬因其有双壳严密保护,环境适应能力极强,在当地的河流,湖泊,湿地大量繁殖,已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114]。 河蚬喜欢穴居,以水底泥,沙作为理想栖息环境,因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色,壳硬且厚,长约1.5~2.8cm,呈圆底三角形,壳顶部向外膨胀,壳面泛有紫色光泽,具有类似同心圆的生长轮脉,适宜生长水温为9-32℃[115],以水中有机碎屑,浮游生物等为食,食性杂,通过鳃滤食食物[116],是一种底栖生物,目前,在我国淮河,黄河,长江,江苏洪泽湖,洞庭湖等淡水水域,河蚬大量分布,在江浙,广东和福建等地,河蚬被大量养殖。河蚬不仅味道十分鲜美,营养价值很高,而且蚬肉可入药,能明目,通乳,利尿,开胃和解救,对心脏病,肝病,高血压具有显著效果[115, 117],具有极高的经济价值和药用价值,在海内外特别是韩国日本市场很热销。 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中,活动能力缓慢,捕捞方便,接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用,是很理想的水体污染指示生物,一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120],目前以牡蛎,紫贻贝,菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122],而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少。河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛,当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究。 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类,是很好的环境毒理学指示性生物[123]。在我国淡水水域分布极为广泛,数量丰富,容易捕捞,与底泥长期直接接触,可以很直接的反应我国各水体污染状况,而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]。先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125]。 目前,国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向:1)河蚬对水体污染物的生物富集效应,Arini[126]等研究了河蚬暴露在Cd,Zn后的回复能力,结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出,而Zn很快就被净化掉。Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况,发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高。李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应,发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22,而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147。以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应。2)对水环境的实时生物监测,目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128],这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上,Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系,并在壳上安装电极来实时监测污染状况,Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系。3)水中污染物的毒理学研究,国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制,评价污染物有微囊藻毒素,有机污染物,内分泌干扰物,重金属,个人护理用品等[8, 9, 131-134]。陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制,发现5和50 μg/L卡马西平暴露后,河蚬Hsp22,Hsp27,Hsp40,Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调,而Hsp60基因表达受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应,结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调,而SOD,CAT,SeGPx和p-GST表达水平降低。 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据。 图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图(图示为中国蛤蜊) 1.7 实验的目的和意义 目前,国内外已经研究神经肽30多年,在人,老鼠上研究的比较成熟,而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点,但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物,没有淡水双壳贝类的相关研究,且环境污染物对神经肽的研究报道非常少。近年来随着溴代阻燃剂的禁用,有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面,而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险,人们对OPFRs的关注度也越来越高,但是对OPFRs的毒理学研究还非常少,对OPFRs的危害评估体系尚不健全。急需建立生态安全评估体系。在生态毒理学受试生物研究上,国内外已经开发了多种受试生物品种,如斑马鱼,大型溞,浮萍,虹鳟,牡蛎,稀有鮈鲫和青鳉等[135-141],但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少,河蚬作为中国本土的底栖物种,分布广,敏感性强,易取样,能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息,为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术,克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin),Conopressin神经肽和FF神经肽基因,并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯,筛查敏感的神经肽标志物,为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制,为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种,陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因,如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中,我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况,两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标,本研究提供了河蚬miRNAs数据,为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖,养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取,然后在3’和5’接头加上测序序列,接着进行反转,建库,PCR扩增,使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA,加接头,最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤,评估序列质量去除低质量序列和3’接头,5’接头和多A序列,计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA,tRNA,snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs:碱基的数量为18到24,自由能≤-20 kcal/mol,并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs,我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs,以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况,总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取,定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China),定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA),定量引物使用miRprimer软件[146]设计,见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏,但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得,使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜,肌肉,消化腺,性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列,清楚污染的和短序列后,我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads(表2-2)。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列,剩下的4995304 reads(代表16144个 不同的reads)被用来预测保守的和潜在的新miRNAs(表2-2)。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp,占了总reads数的14.4%。同样地,在斑点叉尾(25.8%)[143]和珍珠贝中(34.48%)[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs,我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库,允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来(附录4)。此外,这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数,是最多的,紧接着是miR-184(258355),miR-315(220094)和miR-7(144322)(附录2)。在这些保守的miRNAs中,15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知,所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 kcal/mol(附录3)。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝,15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布,我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地,4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)(图2-3)miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高,然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外,miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言,一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高,接着是外套膜,鳃和内脏团。此外,我们发现miR-12主要在腹足中表达,然后依次是内脏团,鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且,miR-184和miR-10表达水平在鳃,腹足和外套膜中几乎一样,在内脏团中明显低。而在新miRNAs中,Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富,在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高,接着是外套膜和鳃,而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达,但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中(鳃,腹足,内脏团,外套膜)的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能,我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件,这款软件允许G=U假阳性,这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人,老鼠,苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言,RNAhybrid是一款简单,快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点,能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用(表2-3),metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992,miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据,并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达,文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158],David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达,能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达,接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达,仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低, 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29],此外,25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000,绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中,我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs,发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前,人,老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟,无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛,牡蛎,章鱼等海洋软体动物,没有淡水双壳类动物的文献报道,神经肽的毒理学研究也很少,开发河蚬典型神经肽标志物,并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考,运用RACE技术,成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长,对全长序列进行了生物信息学分析,使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布,并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响,筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA)公司;荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT) 18、DNase I和dNTP购自Promega(USA)公司;100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物(北京,中国)公司;SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA)公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China)公司; 三氯甲烷,异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA) PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA) Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA) 梯度热循环仪(Veriti thermal cycle system)(Life Technologies,USA) Multiskan GO  酶标仪(Thermo Scientific,USA) 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system(Life Technologies,USA) 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件,Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖,在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集,壳长在1-3cm 左右,年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖,建立一套恒温的流水系统进行养殖,选用水泥池流水循环系统养殖河蚬,以水泵提供流水动力,建有过滤池和养殖池,水经过水泵从过滤池传送到养殖池,再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙,所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水,室内温度使用空调控制,水温保持在20±1oC,水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h:12h,饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻,或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤: 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法,在无菌和无RNA酶的超净工作台进行,具体操作步骤如下: (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管,迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液,然后用电动棒碾磨均匀,接着加入冰预冷的800μL Trizol液,注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%,室温放置5min,使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15 秒,室温放置3 min,然后放入离心机,4℃,12000转,离心15min,吸取上层水相,尽量不要将沉淀吸入,移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀,室温放置10min。 (4)12000 g,4°C,离心10 min,弃上清,此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下: (1)在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA,2μg随机引物和去离子水一共15μL,在金属浴中加热离心管到70℃,5min,这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却,以避免重新形成二级结构,短暂离心,使溶液归于管底; (2)按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分: M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 1.25μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units 0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U 1μL 无核酸水 2μL Total volume 25μL 轻弹或短暂离心混合溶液。37℃孵育60min进行反转录反应,然后在-20℃保存。 3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech)合成 RACE 模板。 (1)Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm) 0.5μL dNTP Mix(20mm) 1.0μL Total volume 5.5μL (2)5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 5′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 8μL (3)3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL (4)(2)和(3)两离心管中的混合物分别混匀,短暂离心。 (5)72°C 下加热3min,然后42°C 下保温2min;在冰中冷却2min后 14000g离心10s。 (6)向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide,轻微振荡后短暂离心。 (7)室温下混合以下试剂: Buffer Mix 5.5μL RNase inhibitor 0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U) 2μL Total volume 8μL (8)向上述混合液中分别加入(6)中的 5′RACE cDNA 和(3)中 3′RACE cDNA,终体积为 20μL。 (9)轻微振动离心管瞬时离心,42°C孵化90min,之后于 72°C下保温 10min。 (10)加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释,cDNA库在-20°C可保存三个月,或在-80°C长期保存。 3.2.4河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因序列片段, 设计3'和5'RACE 特异性引物,引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件进行, 所设计的引物由上海生工生物公司合成(表4-1)。 表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’) Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGG qPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATP管中,加入200μL裂、神经肽标志物的开发还处于起步阶段,完善的标志物评估体系需要进一步建立起来; 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象,以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法



天气冷的时候,最想吃一些暖胃的东西。。。例如,火窝,米饭之类的。。。常常听夏天说,可乐煮菜的效果很好啊。。。有可乐鸡亦,可乐排骨,还有可乐猪肉等。。。既然,高手都那么说,我一定要去试试啊。。。希望大雪的天气快快过去。。过一个团团圆圆的新春佳节日。。。夏天说,可乐里的碳酸与肉,发生了奇妙的关系。。。让你有意想不到的效果。。。尤其用这个肉去配饭,简直是一流啊。。。好好吃的。。。过年的时候,大家有空也去做一下。。。过一个家肥屋润的大新年。。卤肉虽然看起来材料好象挺杂,不过真正做起来倒也简单,就是放在那里煮着就行了。一般这些材料,家里都会有些,不一定和方子上完全一样,取家里有的一些常备的香料同样可以制作。正因为如次,各家的卤肉因为香料上的一些差异,味道是各有其特色。家里有卤肉,第二天的饭桌就容易多了。煮一锅米饭,炒盘蔬菜,做个简单的汤,就可以美美的吃上浇了浓浓卤汁的卤肉饭了。猪肉洗净,放到容器里,加入料酒,再加入足量的清水,以漫过猪肉为准,浸泡半个小时到1个小时,以去除血水;锅里烧开一锅水,除盐以外的所有的材料和肉一块放下去,大火烧开,转小火,慢慢卤制半个小时左右,再加入适盐,继续卤制到需要的软硬程度,可以根据喜好自己调节卤制时间;关火,捞出卤肉到容器中,将卤汁中的香料等捞出,将卤汁倒入装卤肉的容器里,泡着卤肉。待凉,可放冰箱保存。需要食用时,取出适量卤肉和卤汁加热即可。 现在来看看一些传统美食的做法。 现在天气热,卤汁容易酸,所以一次也别做太多。 冰糖为小指头尖那么大颗的;桂皮大约为5CM;干辣椒根据喜好添加。主料:瘦猪肉200克调料:鸡蛋清30克,辣椒(红,尖,干)3克,大葱3克,白皮大蒜3克,姜3克,花生油50克料酒3克,白砂糖3克,酱油5克,香油2克,豌豆淀粉5克,醋3克 先将猪肉切成厚片,用刀背将肉拍松,在肉上打上纵横花刀,切成1.5厘米见方的丁,放入蛋清和淀粉少许,拌匀。将拌好的猪肉放入温油(四五成热)里炸,用筷子将猪肉拨动,使其分开,约炸2分钟,即将猪肉捞出。 将辣椒切成末,和姜片、葱、蒜一同放入油锅里,先炒一炒,随即放入料酒、酱油、糖及少量醋,炒至糖溶化,倒入猪肉,同炒半分钟,出锅时,浇一些香油即成。芹菜炒牛肉是道简单易做的家常小菜,但其鲜香味美,而且营养丰富又能瘦身,简直是爱吃肉又想瘦身人的福音!那芹菜炒牛肉怎么做的呢?芹菜具有一股特殊的芳香,这种芳香有安神镇定、诱人食欲的作用,香味更是浓郁。牛肉补脾胃,芹菜可以促进食欲、降低血压、健脑、清肠利便、解毒消肿、促进血液循环,还含有大量的粗纤维,两者一起食用,可以号称黄金搭档。这个菜在制作中既要注意保证牛肉的滑嫩,又要注意保证芹菜的鲜脆。所以牛肉最好用滑炒得办法,变色即捞出;而芹菜事先用少许盐腌制片刻。这样既可以使芹菜入味,又可以去除芹菜中多余的水分,减少炒制的时间。把牛肉切片后用肉捶敲松牛肉.这一步是炒出的牛肉更滑嫩.(也可拿刀背敲几下).牛肉的纤维组织较粗,结缔组织又较多,应顺纹切条,横纹切片,将长纤维切断;不能顺着纤维组织切,否则不仅没法入味,还嚼不烂。这红烧羊排吃起来相当过瘾!材料羊排、蒜瓣、冰糖、料酒、老抽、盐、胡椒粉做法1、羊排斩成小块,洗净,冷水入锅,烧开后撇去浮沫捞出羊排沥干水分。2、锅内少许油烧热,放入冰糖炒至溶化呈微红色,放入羊排翻炒上色。3、加料酒和胡椒粉炒匀,放适量老抽炒至羊排呈酱红色。4、添水没过羊排,同时扔进几粒蒜瓣同煮。5、大火烧开后转小火炖至汤汁浓稠,加盐调味后出锅即可。法式羊排1000克,胡萝卜1000克,葱姜蒜,干红辣椒,小做法胡萝卜切滚刀块备用;羊排切小块,凉水下锅,大火煮开,去血水和杂质;捞出羊排用热水冲洗干净羊排表面的浮沫,沥干水分备用;起油锅,油热后,爆香葱姜蒜红椒和小茴香;下入羊排大火翻炒至出香味;烹入料酒、生抽喝一点点糖,然后添加热水大火煮开;转中火炖煮40分钟; 添加胡萝卜,调入盐和糖,继续中火炖至羊肉软烂,汤汁收浓,调入味精,撒上香菜,出锅即可。水要一次添足,炖的过程中确需再次添加水,一定要添加开水。相关胡萝卜炖羊排  胡萝卜  呈黄色,鱼嫩蘑香,汁浓味美。材料 主料:鲜活鲤鱼1条(约750克),花生油100克,湿淀粉25克,大葱白5克,酱油25克,松蘑15克,料酒25克,生姜5克,味精1克,胡椒粉1克,辣椒面1克,精盐1.5克,芝麻油2克。将鲜鲤鱼洗净,去鳞,去鳃,在腹剖处用刀划开,去内脏,洗净血沫,两边斜剞5刀。松蘑水发后,洗净泥沙,去蒂根,大葱去皮,洗净,均切成细丝;生姜洗净,去皮,切成片。锅内放入花生油,旺火烧热,稍次序却时,将整条鲤鱼下锅煎成两面成黄色,再烹入料酒,再依次放入辣椒面、松蘑丝、精盐、酱油、姜片、烧开,改小火焖熟,再放入葱白、味精、勾芡,加入芝麻油、胡椒粉,入盘,即可。鲤鱼1条  蒸鱼豉油2汤匙(30ml)  盐1/2茶匙(3克)  料酒1茶匙(5ml)  水发香菇3朵  冬笋50克  青葱3根  姜10克做法鲤鱼去鳞去除内脏,洗净后,用刀倾斜45度,在鱼身上切几刀,深大约2厘米,每刀之间间隔5厘米。在鱼身生反面撒上盐和料酒,用手抹开,腌制10分钟。香菇泡软后切片。冬笋洗净后,切成薄片备用。葱切段,姜切片。将葱段铺在盘子里,放上鱼,在鱼身的切口内,放上一半儿切好香菇片、笋片、姜片,另一半填在鱼肚子里。 淋上蒸鱼豉油,再切少许的葱段和姜丝撒在鱼身的表面。 蒸锅里加水,放入鱼,加盖用大火蒸到冒热气后,继续蒸8分钟即可。取出撒上红椒丝即可。鲤鱼去鳃、鳞、鱼杂,这一系列的工作可以在买鱼时请店家代劳,回家后清洗干净即可。要记得把鱼肚子里的一层黑膜撕掉,否则鱼会有腥味。鱼在洗净后,身上会带有一些粘液,切口的时候要注意安全。对于新鲜的海鲜产品,用清蒸的方法能最大程度的保证味道鲜美。超市中的海鲜酱油、蒸鱼豉油等调料是很好的佐料。蒸鱼豉油除了可以用来蒸鱼,做凉拌菜时候放入,味道也很好。 点缀用的红椒圈儿可以使菜肴变得漂亮。红椒圈儿的做法是,提前将红椒切成细丝,泡在清水里,15分钟就可以变得自然弯曲。相关清蒸鲤鱼  清蒸  鱼   特点: 色泽深红,外脆里嫩,香味扑鼻,酸甜可口。 材料主料:黄河鲤鱼1条(750克左右),辅料:姜未,葱未,蒜未各少许, 调料:醋100克,白糖175克,酱油10克,精盐3克,清汤300克,湿淀粉150克,花生油1750克(约耗150克)。 做法将鲤鱼去鳞、去鳃、去内脏,洗净。在鱼身上每隔2.5厘米距离,先直刻后斜剖刀纹(约1.5厘米深),然后提起刀,使鱼身张开,将精盐撤入鱼身内稍腌,并在刀口处及鱼的全身均匀地涂上一层湿淀粉糊。 炒锅倒油,旺火烧至七成热,手提鱼尾放入油锅内,其刀口处立即张开。这时需用铲刀将鱼托住,以免粘锅,约炸2分钟)用铲刀把鱼推向锅边,使鱼身呈弓形,将鱼背朝下,炸2分钟;再翻过来使鱼腹朝下,炸2分钟;然后再把鱼身放平,用铲刀将头按入油内炸2分钟。以上共炸8分钟,至鱼身全部呈金黄色时,取出放入盘内。炒锅留油少许,烧至六成热,放入葱、姜、蒜未、醋、酱油、白糖、清汤,烧浓后即用湿淀粉勾荧,淋上熟油少许,迅速出锅浇在鱼身上即成。 提示:关键:要注意掌握好火候,初次入锅时锅内油温要高一些(烧至八成热左右),但入锅后不要再加高油温。应炸至呈金黄色,但不要炸焦。醋与糖的比例要适当,其味应是甜中带酸。糖醋卤汁要浓而不厚。 相关糖醋  鱼  主料:750g鲤鱼一条,最好是河里的,味才更好。青椒,西红柿,大蒜,小葱,水豆腐。做法 1,鲤鱼洗净去掉内脏切块,用油爆成8分熟备用; 2,水豆腐用油煎成半黄备用; 3,在锅里放入100g左右花生油烧成6成热后放入切好的西红柿,爆出汁,再放入切好的青椒爆成5成熟,加入适量的盐; 4,把鱼和豆腐倒入锅内,加入150g啤酒和食盐用中火煮,十分钟左右再加入蚝油三汤匙,倒入大蒜,小葱再煮三五分钟即可。相关啤酒鲤鱼  啤酒  鱼   米饭,安佳马苏里拉芝士,鸡蛋,黄瓜,黑胡椒粉,蒜头,鸡精,盐,芝士粉,淡奶油,黄油适量 做法1.黄油在热锅中烧融化,放入拍碎的蒜头炒香 2.放入打撒的鸡蛋炒3.放入黄瓜翻炒,再加入捣散的米饭翻炒4.放入黑胡椒粉,鸡精,盐调味5.倒入适量淡奶油继续翻炒6.饭出锅前撒上芝士粉7.米饭盛入烤碗,烤箱预热200度,烤约25分钟,马苏里拉融化稍微上色即可相关芝士焗饭  芝士  饭  土豆适量,青豆适量,玉米适量,火腿1根,黄油适量,黑胡椒适量 做法 1.青豆,玉米焯水至断生,黄油隔水让其融化,芝士切丝备用。 2.土豆去皮切块,上蒸锅蒸熟。 3.把蒸熟的土豆放大碗里辗成土豆泥。 4.往土豆泥里加入黄油,盐,黑椒粉,玉米,青豆,少量牛奶,充分拌匀后装入烤碗。5.表面撒一层玛苏里拉芝士,再撒一层火腿丁。 6.烤箱预热200度,放中层烤网上,烤15分钟即可。 小诀窍 1.青豆比玉米要难熟很多倍哈,一定要先下锅,待青豆快好时放玉米。 2.加牛奶的时候注意量,加一点点就行,不要把土豆泥调稀了。 相关焗薯  芝士焗薯泥  薯泥  芝士   红薯1个(约250g),芝士1片,黄油25g,白糖20g,牛奶30ml,蛋黄1个(刷在表面用) 做法1、红薯洗净保留外表水分,用一张厨房纸巾包好,纸巾上面沾点水保持湿润。 2、包好的红薯放入微波炉,高火5分钟热熟,取出后将红薯对半切开,用勺子挖出红薯肉(红薯表皮边缘留0.2cm的红薯肉,不要挖得太薄,记得两半红薯皮完整保存) 3、挖出的红薯肉趁热用勺子按压成泥,加入白糖、黄油和切碎的芝士,倒入牛奶拌匀。 4、把拌好的红薯肉放入红薯皮内,表面可撒一些碎芝士。 5、在装好的红薯肉上刷上蛋黄液,放入预热好的烤箱中,80℃烤大约20分钟,取出。 相关芝士  薯   经典的牛肉菜做法。 材料 牛腩2斤,番茄4个,胡萝卜2根,花椒、大料、葱、姜、八角各适量 做法 1、牛腩切块,以开水烫洗两次,洗净。 2、胡萝卜洗净切块。西红柿洗净,切成块。 3、砂锅中加入适量白开水,放入牛腩,同时放入葱、姜、桂皮、八角,加少量醋,盖上锅盖,大火煮开后转文火炖。 4、炖30分钟后,加入胡萝卜块、西红柿块以及少许酱油。 5、炖到2小时左右,加入适量盐。 6、再炖30分钟左右即可上桌。 相关番茄炖牛腩  番茄  腩   牛腩550克,生姜5片,大蒜1根,八角4颗,马铃薯200克,胡萝卜100克,调味料:冰糖30克,海天牌海鲜酱2大匙,生抽1大匙,米酒2大匙,清水1200ml 做法 1.将牛腩切成40mmX40mm见方的块状。 2.锅内烧开水,放入牛腩氽烫至水开,捞起洗净备用。 3.锅内热1大匙油,放入冰糖,小火慢慢煮至溶化,并变为焦糖色。 4.加入姜片,大葱段,八角翻炒出香味。 5.再加入牛腩翻炒至均匀上色。 6.加入米酒,海鲜酱,翻炒至均匀上色。 7.注入清水1200ml,生抽,水量高过肉块约30mm,大火烧开后小火炖90分钟。 8.另起一锅放入1大匙油,放入切块的胡萝卜和马铃薯煎炒至表面微黄色。 9.再将牛腩和汤汁一起倒入锅内。烧开后继续小火炖约60分钟。 10.至汤汁剩下浅浅锅底的时侯,用筷子可以轻松的插入瘦肉部份即可。 小诀窍 1.马铃薯和胡萝卜不要太早放,否则牛腩没烂,它们都煮化了。 2.炒糖色的时侯看见锅子开始,冒烟时就要开始留意了,很快这时糖就会转成焦糖色了。 烧的太久会有苦味。 3.再炖到汤剩下1/3时,就要用筷子把姜,葱,八角夹出来了。 4.红烧牛腩和红烧肉不一样,可以多留些汤汁拌饭吃. 相关红烧牛腩  腩   牛腩500克,花椒,蚝油,砂糖,花雕酒,八角,香叶,桂皮,丁香,茴香,草果 做法 1.牛腩洗净,放锅里加水煮5分钟,去血水,切件备用。 2.准备香料。 3.锅里放油、爆香姜块、倒入所有香料,炒出香味。 4.倒入牛腩翻炒一会。 5.溅入花雕酒继续翻炒。 6.加适量的开水,焖煮至牛腩软淋,加蚝油、白糖调味即可。 相关五香牛腩  五香  腩   牛肚有补益脾胃,补气养血,补虚益精、消渴、风眩之功效,适宜于病后虚羸、气血不足、营养不良、脾胃薄弱之人。 材料 熟牛肚200克,蒜苗100克,油、盐、料酒、糖、胡椒粉、鸡精适量。 做法 1、熟牛肚切丝,蒜苗洗净切段。 2、起锅热油煸炒牛肚片刻。 3、放蒜苗、盐、料酒、糖、胡椒粉、鸡精调味即可。 牛肚500克  红辣椒1个  大葱1根  生姜1块  大料适量  原料  香油6克  酱油6克  料酒大匙  精盐3克  白糖3克 做法 1.大葱洗净切段;红辣椒洗净切片;牛肚洗净,放入沸水中烫煮5分钟,捞出后刮除油脂; 2.把牛肚、料酒、大料、葱段、姜块同放至开水中,煮至牛肚熟烂,待凉后切片装盘; 3.食用前将红辣椒和剩下的葱切丝,撒在牛肚上,淋上调匀的酱油、盐、白糖、香油即可。 注意 爽滑脆嫩,浓香可口。牛肚不宜煮得过烂,有足够的韧性口感会更好。 牛肚有补益脾胃,补气养血,补虚益精、消渴、风眩之功效,适宜于病后虚羸、气血不足、营养不良、脾胃薄弱之人。 材料 牛肚500克,五香粉或卤料、盐、葱姜、料酒、酱油、糖适量。 做法 1、牛肚洗净焯水。 2、锅内加2碗清水和卤料、盐、葱姜、料酒、糖放入压力锅。 3、压力锅冒气后开小火焖煮15分钟。 4、关火后等15分钟没压力时开锅,取出牛肚即可食用。 5、如果想吃麻辣味的浇上辣油即可。 相关五香牛肚  五香  牛   (1)新鲜草鱼一条重约1千克左右,(2)葱段,姜丝,(3)料酒,白糖,辣椒粉,花椒粉,盐,酱油,(4)淀粉,菜籽油 做法 一、将草鱼洗干净后切成大约三厘米左右的轱辘状,放一个干净的盆内备用; 二、将用料中的(2),(3)里的东西全部放入,用量依据个人口味适量,然后盖上盖子腌制5小时左右, 三、取出盆子内的姜丝和葱段,放入一干净的小碗备用; 四、锅内放入适量的菜籽油,烧至八成热时,将裹好淀粉的鱼块依次放入锅内,炸至两边金黄色时,取一干净的盘子装入备用; 五、用锅里的余油将刚才小碗内的姜丝和葱段放入煸至经黄色时,倒入适量的开水,再依次放入鱼块,当汤汁收至快干时关火,出锅装盘即可。 小诀窍 洗鱼时在鱼身上倒上少量的醋,这样鱼鳞容易去掉,且鱼身不滑好洗; 炸鱼之前一定要拌入少量的淀粉,这样就不会粘锅了。 相关烧草鱼  草鱼   草鱼,葱,姜,辣椒,花椒 做法 1、鱼头、鱼尾切下。把鱼片成片,片好的鱼片用盐、料酒、姜米腌制15分钟。 2、加工调料吧:葱切段。姜分两半,一半切丝,一半切片,丝是做炒料,片是与鱼同煮的。辣椒要红红的才有感觉滴,而且它很辣。 3、将锅放火上加水放入鱼头尾、鱼皮、葱姜料酒煮熟后下入片好的鱼片。锅开即好。 4、另用一锅,将小米椒、泡姜、泡缸豆、葱姜蒜、辣椒、花椒放入炒锅炒香,倒入鱼锅内即成。做好了,看看成品吧~ 相关水煮草鱼  水煮  鱼   葱丝少许,姜丝少许,打算两瓣,蒸鱼豆豉2茶勺,油5ml,花椒少许,盐少许,料酒2茶勺 做法 1、先把鱼用料酒和盐腌制30分钟。 2、水开后,上锅蒸8分钟。取出,把盘子里的水倒掉。 3、加入葱姜丝,倒入蒸鱼豆豉。注意:一定要贴边倒,不要直接浇在鱼身上。上锅继续蒸5分钟。 4、另起锅加油,烧热,加花椒少许。等花椒变黑后,关火。 5、在蒸好的鱼身上撒少许香菜,然后把步骤(4)浇在上面就ok了。 小诀窍 1、蒸鱼豆豉不要直接浇在鱼身上。 2、葱姜丝不要先放。 大头的草鱼半边,香菇,鸡蛋,青豆,洋葱,番茄,姜,蒜,生抽,番茄酱,芝麻油,陈醋,淀粉,盐,糖 做法 1.番茄、香菇、洋葱切丝;姜蒜切片 2.在草鱼表面切十字刀,放入生抽、淀粉、盐、半个鸡蛋液拌匀,腌制10分钟 3.将鱼下油锅,炸成金黄色,捞起沥油 4.锅里放少许油,将葱姜爆香 5.放入番茄,小火炒到出汁 6.放入洋葱、香菇、青豆,盐,略炒 7.放一碗清水煮开(多放点) 8.放适量的番茄酱、糖、陈醋煮开 9.最后水淀粉勾芡。将汤汁淋在炸好的鱼上即可~~~ 色红亮,肉细嫩,味甜酸。 材料 主料:草鱼肉500克,番茄酱50克。柠檬酸微量,绍酒10克,精盐2.5克,白糖20克,味精0.5克,鲜汤50克,熟菜油750克。 做法 选新鲜草鱼肉片切成1厘米厚的片,与绍酒,精盐拌匀,柠檬酸用适量清水溶化。 2、油锅烧六成热,下鱼肉炸至呈黄色时捞起。 3、炒锅置中火上,下熟菜油50克烧至三成热,放入番茄酱炒香至油呈红色,又放入白糖,柠檬酸,鲜汤推匀,再放入鱼片裹匀茄汁,起锅盛盘。 相关茄汁草鱼片  茄汁   主料:海鲈鱼一条(约2斤) 调料:白糖、黄酒、酱油适量,葱切丝、蒜切末、姜切丁(因我家中鲜姜被吃光,故用姜粉)、植物油二两,少许盐 做法 1、鲈鱼挖腮、去鳞、掏脏、剪鳍,清洗几遍,控干水分。接着在鱼身两边斜割几道口子,目的在于入味。 2、锅中置油,烧热后下入葱丝、蒜末,煸出香味,将鱼下锅两侧均匀煎,煎到金黄色,即关火。我家锅小,为了将这条鱼煎整,可真费劲了! 3、鱼煎好后,锅中倒进黄酒、酱油、白糖、少许盐,冲入适量水,烧开后盖住锅盖,文火慢炖十几分钟。 4、十几分钟后,旺火收汤,关火起锅,撒少量葱丝,这道菜就成了。 小诀窍 原本还应放豆豉酱,但我家小儿怕辣,只能弃之。如用豆豉酱,即不必放盐。 黑鱼。姜。 做法 1、黑鱼去鳞和内脏,清洗干净后,顺着鱼骨片成大的鱼肉。再切成鱼片备用; 2、锅里热油,放入姜擦锅。放入鱼头、鱼骨、鱼尾,小火慢煎,一面成型后再小心翻面煎另一面,这样就不会糊底; 3、烹入足够的开水,放入葱姜,盖上锅盖,中小火熬汤; 4、熬到鱼汤变白,放入鱼片,小心拨散,放入盐调味; 5、烹入黄酒,撒些胡椒粉,等鱼片变白即可。 相关鱼汤  汤   主料:黑鱼 600克,酸菜250克,干辣椒10克, 泡椒10只。 调料:葱1根,姜1块,蛋清1个盐 做法 1.将鱼清理干净,切去头部,去除鱼骨,片成鱼片备用; 2.鱼片中放入蛋清,少许淀粉,盐,黄酒,生抽腌制5分钟; 3.锅中倒入少许油,放入花椒、葱段和姜片、干辣椒煸香后,倒入酸菜翻炒,炒熟后,加入少许盐调味; 加入适量的水焖煮约20分钟,煮出酸辣味. 4.打开锅盖,放入黑鱼片,轻轻涮一下即可. 相关水煮酸辣黑鱼  水煮   主料:韩国辣白菜400克,黑鱼一条,老豆腐100克,年糕片100克,茼蒿100克,金针菇100 克,青红椒各50克; 调料:韩国辣椒酱50克,大豆酱50克,白糖40克,味精10克,牛肉粉20克,盐20克,圆葱丝20克,蒜末10克。 做法 1:先做一锅辣白菜汤,锅做底油下入圆葱丝与韩国辣白菜同时煸炒出香,加水1000克烧开,然后下入以上调料调味,小火烧十五分钟待辣白菜的味道与汤融和即成韩国泡菜汤。 2:将泡菜汤盛入火锅内摆上老豆腐,年糕片,茼蒿金针菇与青红椒。 3:将黑鱼去骨片成片,用少许盐味精和半个鸡蛋清将鱼掩一下,锅上火烧一锅开水将腌好的鱼下入烫至七成熟取出放在火锅内摆好即成。 相关泡菜黑鱼火锅  火锅  黑鱼   鲳鱼含有丰富的不饱和脂肪酸,有降低胆固醇的功效;含有丰富的微量元素硒和镁,对冠状动脉硬化等心血管疾病有预防作用,并能延缓机体衰老,预防癌症的发生。 材料 鲳鱼500克,葱姜、油、盐、酱油、五香粉、鸡精、糖适量。 做法 1、鲳鱼整理干净。 2、起锅热油爆香葱姜蒜,煎鱼2分钟。 3、放酱油、料酒、糖和1碗水小火焖煮10分钟。 4、放盐和鸡精即可。 武昌鱼一条800克左右,葱丝,姜丝,红椒丝 做法 1.将去了鳞鳃和内脏的鱼冲洗干净,在距鱼头一厘米处划开,轻轻拽出里面的腥线,注意两面都有哦 2.两面分别划几刀,抹上盐和料酒,鱼腹里也要抹上,腌10分钟左右 3.盘子底部撒点葱段、姜片,将鱼放进盘子里,鱼腹里和鱼身上面都撒上葱姜丝 4.蒸锅里放适量清水,烧开后将鱼放进锅里蒸7-8分钟,然后关火再虚蒸2-3分钟 5.取出鱼,拣去葱姜丝,另取一个盘子将鱼放进去,在鱼身上再撒上新切的葱丝、姜丝、红椒丝 6.炒锅注少许油烧热,将蒸鱼盘里的蒸鱼汁倒进锅里,再放入适量蒸鱼豉油,烧开后均匀地浇在鱼身上即可 美味可口的鱼类能让我们吃的营养又健康, 因此在我们的餐桌上离不开鱼。而对于湖北人来说, 武昌鱼是我们最常吃的鱼类一,价格实惠又新鲜。毛泽东有句很有名的诗词,“才饮长沙水,又食武昌鱼”, 也让它全国闻名。当然不仅仅是因为这, 还因为武昌鱼营养丰富,它富含胶原蛋白,能够增强身体活力修补人体细胞组织;还能滋补健胃、补气血、利水消肿、通乳、清热解毒等功效;它里面含有微量元素可以提高人体的免疫力,对增强体质很有好处。 武昌鱼肉质细嫩、柔软,容易被消化, 且味道鲜美。它的做法多多,红烧、清蒸。。。都很好吃, 因此非常受大家欢迎。今天会用豆瓣酱来烧,就只仅仅多一味调味料, 确让武昌鱼增味不少。 要做好这烧鱼最关键就是煎鱼, 鱼皮要煎的焦黄且鱼皮不破损。其实这是有小窍门的,锅底先用姜擦拭一遍, 而鱼入锅前要控干水分;煎鱼时不要急于翻动, 要小火慢慢煎,轻轻晃动锅,当鱼能跟着晃动时再翻面。只要掌握了这几点,对于不经常下厨的人来说也能煎出完整的鱼皮来。 煸炒出豆瓣酱的香味, 就可以放入煎好的武昌鱼, 加水炖煮就行了。经过近十分钟的炖煮, 满厨房都飘出香味, “豆瓣烧武昌鱼”就完成了。做法很家常, 但油亮香浓,味厚鲜醇, 色香味俱全, 吃起来足够诱惑。 1. 先将鱼的上、下表面划上几道, 加入盐、姜片和白酒帮助其入味与去腥; 2. 煎鱼时为了避免鱼皮煎破,可以用姜将锅底擦拭一遍;鱼入锅时要将表面水分吸干; 煎鱼不要急于翻动,一定要等到晃动锅时鱼也能跟着动再翻面; 3. 我偷懒了, 没有把鱼拿出来, 直接在鱼边上煸炒了豆瓣酱;如果觉得不方便,还是将鱼拿出来,煸炒豆瓣酱后再将鱼下锅; 4. 加入适量的生抽和水,加盖炖煮鳊鱼,约五--八分钟,再加入少量的盐(豆瓣酱已经很咸了)开大火收汁,注意中间将鱼翻面一次,也要不停将汤汁浇在鱼的表面上,让鱼更入味。 相关昌鱼  豆瓣  鱼   主料:海鲈鱼一条(约2斤) 调料:白糖、黄酒、酱油适量,葱切丝、蒜切末、姜切丁(因我家中鲜姜被吃光,故用姜粉)、植物油二两,少许盐 做法 1、鲈鱼挖腮、去鳞、掏脏、剪鳍,清洗几遍,控干水分。接着在鱼身两边斜割几道口子,目的在于入味。 2、锅中置油,烧热后下入葱丝、蒜末,煸出香味,将鱼下锅两侧均匀煎,煎到金黄色,即关火。我家锅小,为了将这条鱼煎整,可真费劲了! 3、鱼煎好后,锅中倒进黄酒、酱油、白糖、少许盐,冲入适量水,烧开后盖住锅盖,文火慢炖十几分钟。 4、十几分钟后,旺火收汤,关火起锅,撒少量葱丝,这道菜就成了。 小诀窍 原本还应放豆豉酱,但我家小儿怕辣,只能弃之。如用豆豉酱,即不必放盐。 已经到了无香料不欢的我,不管什么料理就是要有香草及香料,因为那决定你料理更上层楼的王牌。 大茴香的的味道一般比较常出现在泰式料理,一般市场也少有,这道菜如果少了大茴香也没关系,可以用香菜或芹菜代替,风味会改变,但是美味不变。 主料银鱼配料蛋清调料盐、鸡粉、胡椒粉、料酒、淀粉、花生油 做法 1.银鱼洗净,腌制入味。 2.蛋清、淀粉调匀成糊。 3.加银鱼拌匀。 4.用热油将鱼炸熟装盘即可。 小诀窍 特点 色泽淡黄,外脆里嫩,滋味鲜香。 提示 银鱼提前腌;挂糊时可加适量花生油。 相关炸银鱼  软炸银鱼  软炸   简单做菜还不能缺乏营养,蛋羹可以单独做,也可加肉糜。加了银鱼干,更鲜。懒人自有懒办法,看看,不喜欢做菜菜,就做个滑嫩的豆腐般的蛋羹,(还是日本豆腐捏)好吃不流汗。 材料 鸡蛋一枚,银鱼少许,水,香油 做法 1.鸡蛋打入适合的容器,加少许盐,用手动打蛋器打散。至鸡蛋稍变浅黄色。 2.加入和鸡蛋液一样多的冷水,再次打均匀。将洗净的银鱼干放入蛋液中。 3.蒙上保鲜薄膜,并用牙签戳上几个洞。 4.将碗放入有水的锅中,隔水蒸7--8分钟。 5.出锅后滴少许香油,即可。 小诀窍 1.蛋和水一定要一比一,将蛋液打至淡黄色也可。 2.一定要加保鲜薄膜,并扎小眼儿。以防水蒸气滴入鸡蛋中,形成积水。 3.火候的把握很重要,中火即可,不能用太大的火,避免急火后蛋羹变老。 4.没有银鱼可以不放。放入银鱼的话,盐要少放。 相关银鱼蛋羹  蛋羹  鱼蛋   大虾 葱 姜 糖 做法 1、大虾洗干净,剪掉须子和虾枪,背部剪开去掉沙线 2、葱、姜都切成一寸左右细丝 3、锅放油(比炒菜略微多一点),5成热时倒入大虾翻炒,马上倒入料酒(不要太多)、葱丝、姜丝、盐,继续翻炒,盖上盖子闷一下 4、加入水,不要太多,没过大虾一点应该就可以了,继续烧,加一点糖,火可以稍微关小一些 5、看到红色虾汁开始变浓稠了,点一点儿醋,注意别太多,这时候虾皮就会变得比较酥脆,再最后翻动几下。 6、好了,可以出锅了,但是一定要注意保留一些汤汁,小孩子们都喜欢用虾肉蘸汤吃,回味无穷哦! 海虾1斤,姜丝一小把(宜多不宜少),白糖2大匙,盐1小匙,番茄酱2大匙,橄榄油普通炒菜用量 做法 1、去除虾线。沿虾背脊剪开一条口子,取出虾线。将去除虾线的虾用水洗净,并将水沥干。 2、姜切丝,备用。 3、热锅凉油,待油八成热放入姜丝煸炒,爆出香味后倒入大虾煸炒,虾变红后加入盐和糖继续煸炒,盖锅盖焖一下,然后倒入适量番茄酱翻炒均匀就可以出锅了。 小诀窍 1、虾的水分一定要沥干,因为在煸炒时放过盐后虾会出一些水,如果之前不沥干炒出的菜品就会很水。 2、姜丝可以稍微多放一些,即可以去除虾的腥气,也可以平衡虾的寒气。 这种虾的做法最受欢迎,经过油爆后的大虾,吸收了蒜的香味,加之生抽激味,那个香气一瞬间就能让人倾倒。再加点白糖和水,稍微焖煮2分钟,虾身Q弹,汤汁甜美,将之拌饭,一盘虾连肉带汤,轻易间就消灭殆尽。 材料 大虾1斤,生抽2大匙,白糖1大匙,去皮蒜4瓣,水适量 做法 1.虾洗干净后,剪去虾枪,沥水待用。 2.锅中入油,4分热后入大蒜瓣爆锅,至蒜瓣金黄色,倒入大虾爆炒半分钟,倒入生抽、白糖,炒匀后,倒入没及一半虾身的水,盖盖煮开后,再煮两分钟即可。 小诀窍 1、【挑选虾的办法】:鲜虾色青白,外皮光亮,虾壳坚硬,眼睛外凸,虾须硬挺.虾身完整,肉质坚实,味道腥鲜。千万不可购买掉头、缺尾、脱皮、体色发红,有异味的虾。那样的虾已经不新鲜了。如果买到,也只适合炸制。 2、老抽颜色太深,不建议用。 3、生抽已经有咸味,无需放盐。 4、糖要多放点,下味重点才好吃。 5、烹制这道菜,我不喜欢放姜,感觉姜的味道与虾的味道不相配。 相关红烧大虾  虾   桂鱼、青椒、芝麻、陈醋、蒸鱼豉油、耗油、生粉、大蒜、葱姜、料酒、香油 做法 1、将桂鱼洗净,青椒洗净切圈备用; 2、锅中倒油,加热后将桂鱼置入锅中,两面炸至微黄,乘出待用; 3、锅中倒油,放入大蒜、葱姜、青椒爆炒; 4、将桂鱼一起放入锅中,加入蒸鱼豉油、耗油、料酒加入少许水,小火收汁; 汤汁浓稠后,加入少许陈醋; 5、起锅后滴入少许香油。 相关红烧桂鱼  鱼   梅干菜国人无人不晓无人不知,梅菜扣肉就是一道经典的江浙传统菜肴,倍受南北国人的喜爱。 梅干菜最初多为居家自制,晾干菜叶、使其堆黄,然后加盐腌制,最后晒干装坛, 但它还有芥菜干、油菜干、白菜干、雪里蕻干之别。 成品梅干菜油光黄黑,香味扑鼻,解暑热,洁脏腑,消积食,治咳嗽,生津开胃。 梅干菜与肉的绝配已经定格为百姓的经典,昨晚我们一家人在学到一盘新派本帮菜 不要看着鱼肉雪白鲜嫩,蘸一点汤汁,已经很入味了,浓浓的梅干香,还有肉香的余味。上海人吃剩的梅干菜烧肉,拿来烧桂鱼,是新派的本帮菜,好吃,值得推荐。 一、准备食材 1、提前浸泡梅干菜估计2-3小时就可以,我是泡了一夜; 2、豇豆折成段,半个食指长短即可,清洗干净,沸水焯一下待用; 3、桂鱼去肚去鳞处理干净,身上划上几刀待用; 4、五花肉切片,厚度1CM; 二、开煮(先煮肉) 1、 热锅下五花肉干锅翻炒,撒少许盐,据说这样容易把五花肉的肥膘逼出油来; 2、然后加1小勺的生抽上色,倒入泡好的梅干菜,加4勺糖加清水没过肉,大火开煮; 3、煮开后,改小火慢炖半小时,倒入豇豆拌匀,继续小火焖煮半小时出锅; 4、把肉和豇豆挑出来盛在盘里,余下的梅干菜留着准备烧鱼。 三、梅干菜桂鱼 1、鱼身上拍少许淀粉、面粉都可以,技术不过关的煎鱼就用干粉可以保持鱼身完好; 2、热锅下适量油,将拍好干粉桂鱼下锅,两面煎一下; 3、将1勺生抽均匀撒在鱼身上,再将煮好的梅干菜都倒入锅内; 4、梅干菜刚好覆盖整鱼,再撒两勺糖,加少许清水,大火开煮; 5、煮开后改小火,记着煮8-10分钟即可,不然桂鱼就老了。 美食的魅力真是美不可言啊,朋友们你们学会了吗。

雷火论坛
为大家奉上精彩文章


关注


经由爱无界,爱上你自己
公众微信号| aiwujie12111
小编微信| awj12111
电话:15303416946